westernblot原理及应用点击上方蓝字关注我们原理：蛋白质免疫印迹是用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术。
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westernblot原理及应用
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原理：
蛋白质免疫印迹（Western Blot）是用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术。电泳分离后的蛋白质从凝胶转移到固相载体（如PVDF膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变，以其作为抗原，与对应的第一抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体反应，经过底物显色或放射自显影，通过观察着色的位置和着色深度等，可获得蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况及蛋白成分等信息。
关于蛋白提取：
1. 裂解buffer：每种裂解buffer都有其擅长的用途，市面上常见的裂解buffer见下表：
Tips：
除了这些裂解buffer以外，为了防止蛋白降解、去磷酸化，各种蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂都是必须的；在提取蛋白的时候仅仅靠裂解液有时候也不能达到完全抽提的效果，有条件的话，可以对抽提悬液进行10-20s的超声破碎处理；此外如果没有裂解buffer，可以用1×SDSloading buffer代替来抽提蛋白，其效果类似于SDS裂解液，不过抽提后的样本不能进行浓度测定。
2. 干扰蛋白：培养细胞、动物组织都存在血清成分，血清中存在大量的白蛋白与免疫球蛋白，这些蛋白会经常性的出现杂带干扰，一般白蛋白杂带在70kDa处，免疫球蛋白杂带出现在50kDa处；有人怀疑：“我的抗体也不识别这些蛋白啊！”，现实不是这样的，当某种蛋白含量超过一定量的时候，即使很少的非特异吸附都有可能造成信号的富集而造成杂带；建议广大战友在提取细胞蛋白的时候，一定要使用PBS漂洗细胞至少3次，去除残留的培养基成分；提取组织的时候，尽量去除组织中血液的残留，这样样本中的干扰因素才会减少到最低。
2
关于胶浓度及电泳条件的选择：
正确选择凝胶浓度与电泳条件能够让目的蛋白区域最大限度的分离开，从而使条带的位置，杂带位置等一些因素的影响降到最低；胶浓度及电泳条件的选择见下表：
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关于转膜的条件与注意事项：
1
转膜条件：
对于分子量10-15kDa的指标转膜时间不宜过长，100V、冰浴45min足矣；对于分子量指标150kDa以上的指标，100V、冰浴2h也足够了；其他介于15-150kDa之间的指标100V、冰浴1h完全可以保证效果。
2
转膜操作：
准备PVDF膜的大小要与切割后的凝胶大小一致或略小，滤纸和海绵大小也要一致；制作“三明治”不能太厚也不能太薄，太厚容易使胶变形，条带弯曲，太薄气泡容易进入，导致条带不完整，这些都可以用增加减少滤纸量来改善；一定要把目的蛋白分子量区域贴在膜的中间部位；分清楚正极与负极，避免反方向转印；转印缓冲液要提前预冷，整个转印过程也需要在冰浴中进行。
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关于分子量实际与预测结果的差异：
可能导致预测与实际分子量不一样的因素：1
预染marker的误差：
由于预染marker是由标准蛋白与有色染料偶联而成的，所以偶联后的蛋白由于表面结构的改变，导致在SDS-PAGE中分离的线性关系没有天然蛋白那么好；另外由于偶联的批次不同，每个条带针对每个批次呈现出的分子量会有些许的变化，所以在使用预染marker的时候，出现5-10%的分子量误差是不能避免的，如果需要确切分子量需要用非预染marker来标定；
2
物种差异：
很多蛋白在人源、大鼠源、小鼠源中存在的长度并非完全一致，具体问题还要具体分析；
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蛋白本身的性质：
①分子量数值仅仅是一个氨基酸数值累加的相对值，与实际值本身存在差距；
②蛋白质存在磷酸化、乙酰基化、糖基化等翻译后修饰可导致分子量增大，比如常见的CD家族蛋白糖基化修饰以后分子量都会增大许多；
③蛋白质存在翻译后酶前体状态与激活剪切状态，可使分子量变小，比如MMP2蛋白，酶源与激活态大小分别是72kDa、63kDa；
④蛋白质存在多个转录本由一个基因编码的形式，不同的转录本翻译得到的蛋白分子量不一样，比如JNK这个蛋白，本身分为JNK1，JNK2，JNK3三个亚型，三种亚型同源性较高，而且针对每个亚型还有不同分子量的转录本呈现；要想正确把握蛋白分量问题不仅仅要读说明书，还要关注这个蛋白的相关背景知识；
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关于封闭
封闭也是Western中比较关键的环节，一般常规的条件是5%脱脂奶粉溶于1×TBST中，常温下摇床缓慢摇晃，封闭1h；除此之外还需要向大家介绍另外一种封闭液—0.5% 明胶，这两种封闭液都适用于常规的Western实验，他们之间的取舍关系可近似认为，如果用脱脂奶粉封闭结果是“白板”或者信号较弱，可以考虑换明胶；如果用明胶封闭，结果杂带较多，背景较深可以考虑用脱脂奶粉；甚至有的时候两者可以混合起来使用，具体的细节需要大家在实验中细细品味。
在Western Blot实验中通常需要注意以下几个问题:
1. 免疫印迹杂交的敏感与检测系统有关.因此,凝胶电泳时的蛋白上样量应该保证被检测抗原量不至于太低,如果过低应该重新纯化和浓缩使用,或者建议做一次梯度稀释,上样电泳后,直接考马斯亮蓝染色选择最佳上样量,纯化和浓缩的蛋白质样品必须注意盐的浓度过高,可平衡一下盐的浓度,如,透析。
2. 形成凝胶的试剂要有足够的纯度,激活剂的浓度适当,不仅可以决定凝胶聚合的速度,也将影响凝胶的质量,聚胶时的温度也将影响凝胶聚合的速度.因此,建议要根据不同温度下适量增减激活剂的用量以保证分离胶从加入激活剂起至开始出现凝胶凝聚的时间为15-20分钟最佳,对于浓缩胶最佳聚合时间为8-10分钟开始可见聚合.灌完分离胶加水封闭分离胶与外界氧气的结合。
3. 未聚合的丙烯酰胺具有神经毒性,操作时应该戴手套防护.梳子插入浓缩胶时,应确保没有气泡,可将梳子稍微倾斜插入以减少气泡的产生,梳子拔出来时应该小心,不要破坏加样孔,如有加样孔上的凝胶歪斜可用枕头插入加样孔中纠正但要避免枕头刺入胶内。
4. 电泳槽内加入电泳缓冲液冲洗清除黏附在凝胶底部的气和未聚合的丙烯酰胺,同时建议低电压短时间的预电泳,清除凝胶内的杂质,疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通(恒压10-20V,20-30min)。
5. 加样前样品应先离心,尤其是长时间放置的样品,以减少蛋白质带的拖尾现象。
6. 为避免边缘效应,可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液。
7. 样品缓冲液中煮沸的样品可在-20存放数,,但是反复冻融会使蛋白质降解。
8. 为减少蛋白质条带的扩散,上样后应尽快进行电泳,电泳结束后也应直接或者转印。
9. 上样时,小心不要使样品溢出而污染相临加样孔。
10. 取出凝胶后应注意分清上下,可用刀片切去凝胶的一角作为标记(如左上角)转膜时也应用同样的方法对NC膜做上标记(如左上角)以分清正反面和上下关系。
11. 转膜时应依次放好NC膜与凝胶所对应的电极,即凝胶对应负极,NC膜对应正极。
