四个月后，导演杨凡在看到吴彦祖拍摄的服装广告后，与他接洽成为他下一部电影的演员，而吴彦祖表示自己没有表演经验而拒绝了。2005年，凭借动作片《旺角黑夜》首次提名第24届香港电影金像奖最佳男主角。2010年，担任监制并主演了爱情片《如梦》，凭该片第二次提名第46届台湾电影金马奖最佳男主角。2014年，主演犯罪片《魔警》，凭该片第二次提名第34届香港电影金像奖最佳男主角；同年，主演个人首部美剧《荒原》系列。
24日，吴彦祖晒出与父亲的一张合影，透露父亲在93岁生日前夕离世，“生日快乐爸爸！再过一天，你就93岁了，但我猜你是急着要加入妈妈的行列。我现在能看到你们两个在一起，这让我很高兴。谢谢你，我所知道的一切都是从你身上学到的。安息，爸爸。”
吴彦祖出生于加利福尼亚州伯克利，并在奥林达长大。6岁时，吴彦祖在看完功夫电影《少林寺》后，对武术产生了兴趣。11岁时，吴彦祖便拜一名北京艺人为师开始习武，教他的师父是吴彦祖的母亲找的，而此前，他的母亲还担心他学会了功夫跟人打架，但最后还是拗不过他对习武的热情。高中时，吴彦祖也曾叛逆过，经常在街上玩滑板，听的是朋克、重金属、饶舌等地下音乐，喜欢打架更甚于学习。这一切直至他的母亲因心脏病住院才有了彻底的改变。在母亲生病期间，吴彦祖白天在学校认真读书，下课后就到医院陪母亲。为此他甚至去学习了简单的气功疗法，用来辅助母亲的治疗。
1993年，吴彦祖在美国俄勒冈大学攻读建筑系，并获得建筑副修奖学金。1994年，吴彦祖赢得California Martial Art Competitions的亚军，并在美国西岸排名第二位。同时，吴彦祖还成立了俄勒冈大学中国武术学会，并成为第一任教练，收了二十几个徒弟，一共教了五年。1995年，吴彦祖随师父到北京什刹海武校参加集训，并获得了北京国际武术比赛长拳组第五名，太极拳组第六名。
1997年，毕业后的吴彦祖前往香港旅行，后在姐姐的建议下开始当模特。四个月后，导演杨凡在看到吴彦祖拍摄的服装广告后，与他接洽成为他下一部电影的演员，而吴彦祖表示自己没有表演经验而拒绝了。后来杨凡天天给吴彦祖打电话并说服了他。
1998年，吴彦祖被杨凡导演选中，接拍了个人首部电影作品《美少年之恋》，他在片中饰演帅气十足的警察Sam ；同年10月，被张婉婷选中出演爱情文艺片《玻璃之城》，吴彦祖凭借在该片中的表现提名第18届香港电影金像奖最佳新演员。
2004年，因出演动作片《新警察故事》中关祖一角受到广泛关注，并凭借该角色获得第41届台湾电影金马奖最佳男配角奖。2005年，凭借动作片《旺角黑夜》首次提名第24届香港电影金像奖最佳男主角。
2006年，执导了个人电影处女作《四大天王》，凭该片获得第26届香港电影金像奖新晋导演奖。2010年，担任监制并主演了爱情片《如梦》，凭该片第二次提名第46届台湾电影金马奖最佳男主角。2011年，在爱情片《单身男女》中饰演建筑师方启宏。2012年，在警匪片《窃听风云2》中饰演司马念祖。
2014年，主演犯罪片《魔警》，凭该片第二次提名第34届香港电影金像奖最佳男主角；同年，主演个人首部美剧《荒原》系列。2015年，主演励志片《滚蛋吧！肿瘤君》。2016年，在奇幻片《魔兽》中饰演古尔丹。2018年，吴彦祖参与设计的作品“木兰坊”入围了英国皇家建筑师学会奖；同年，在动作片《古墓丽影：源起之战》中饰演陆仁。2020年，在警匪片《除暴》中饰演张隼。
